摘要：以液體為流動相的色譜法稱為液相色譜法。用常壓輸送流動相的方法為經典液相色譜法，這種色譜法的柱效能低、分離周期長。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）是在經典液相色譜的基礎上發展起來的一種色譜方法。與經典的液相色譜法相比，高效液相色譜法具有下列主要優點：①應用了顆粒極細（一般為10µm以下）、規則均勻的固定相，傳質阻抗小，柱效高，分離效率高；②采用高壓輸液泵輸送流動相，流速快，一般試樣的分析需數分鐘，復雜試樣分析在數十分鐘內即可完成；③廣泛使用了高靈敏檢測器，大大提高了靈敏度。目前，已經發展了多種不同的固定相，有多種不同的分離模式，使高效液相色譜法的應用范圍不斷擴大。下面介紹高效液相色譜法的有關知識，新的方法和技術以及在藥物分析中的應用。

一、分類
    高效液相色譜法按分離機理的不同可分為以下幾類：
    (一)吸附色譜法（adsorption chromatography）以吸附劑為固定相的色譜方法稱為吸附色譜法。使用最多的吸附色譜固定相是硅膠，流動相一般使用一種或多種有機溶劑的混合溶劑。在吸附色譜中，不同的組分因和固定相吸附力的不同而被分離。組分的極性越大、固定相的吸附力越強，則保留時間越長。流動相的極性越大，洗脫力越強，則組分的保留時間越短。
    (二)液-液分配色譜法（liquid- liquid chromatography)液-液分配色譜的固定相和流動相是互不相溶的兩種溶劑，分離時，組分溶入兩相，不同的組分因分配系數（K)的不同而被分離。目前廣泛使用的化學鍵合固定相是將固定液的官能團鍵合在載體上而制成的，使用化學鍵合固定相的色譜方法（簡稱鍵合相色譜法）可以用分配色譜的原理加以解釋。鍵合相色譜法在HPLC中占有極其重要的地位，是應用最廣的色譜法。按照固定相和流動相極性的不同，分配色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法兩類。
    1.正相色譜法（normal phase chromatography)固定相極性大于流動相極性的分配色譜法稱為正相分配色譜法，簡稱為正相色譜法。氰基鍵合硅膠、氨基鍵合硅膠等極性的化學鍵合固定相是正相色譜常用的固定相，正相色譜的流動相一般為極性較小的有機溶劑。在正相色譜中，極性小的組分由于K值較小先流出，極性較大的組分后流出。正相色譜法用于溶于有機溶劑的極性及中等極性的分子型物質的分離。
    2.反相色譜法（reversed phase chromatography）流動相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相分配色譜法，簡稱為反相色譜法。反相色譜法使用非極性固定相，最常用的非極性固定相是十八烷基硅烷鍵合硅膠，還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等。流動相常用水與甲醇、乙腈或四氫呋喃的混合溶劑。在反相色譜中極大的組分因K值較小先流出色譜柱，極性較小的組分后流出。流動相中有機溶劑的比例增加，流動相極性減小，洗脫力增強。反相色譜法是目前應用最廣的高效液相色譜法。
   (三)離子交換色譜法(ion exchange chromatography)離子對交換色譜法是以離子交換劑為固定相的色譜方法，組分因和離子交換劑親和力的不同而被分離。柱填料含有極性可離子化的基團，如羧酸、磺酸或季銨離子，在合適的PH值下，這些基團將解離，吸引相反電荷的物質。由于離子型物質能與柱填料反應，所以可被分離。
樣品中不同的組分因離子交換平衡常數的不同而分離。離子交換色譜的流動相一般為一定PH值的緩沖溶液，有時也加入少量的有機溶劑，如乙醇、四氫呋喃、乙腈等，以增大組分在流動相中的溶解度。流動相的PH值影響離子交換劑的交換容量。對弱酸或弱堿性的被分離組分，流動相的PH值還會影響其電離狀況，流動相的PH值必須使待分離組分處于離
解狀態，才能被分離。離子交換色譜法用于分離在測定條件下呈離解狀態的組分，如具有酸性或堿性的化合物，反相離子對色譜法在藥物分析中的應用非常廣泛，例如生物堿、磺胺類藥物、某些抗生素及維生素等的分析均可采用此方法。
   (四)空間排斥色譜法（steric exclusion chromatography）空間排斥色譜也稱為凝膠色譜。其固定相是具有一定孔徑范圍的多孔性物質，即凝膠。被分離組分因分子空間尺寸大小的不同而被分離。當組分被流動相攜帶進入色譜柱時，體積大的分子不能進入固定相表面的孔穴中，而隨流動相直接通過色譜柱，保留時間最短。體積較小的分子可以進入孔穴內，在色譜柱中所走的途徑較長，保留時間也較長。分子的尺寸越小，可進入的孔穴越多，所走的路徑越長，保留時間也越長。因此，凝膠色譜中，在一定范圍內，體積不同的分子保留時間不同，從而達到分離的目的。凝膠色譜法主要用來分離高分子化合物，如蛋白質、多糖等。由于分子量和分子體積有關，凝膠色譜還可以用來測定組分的分子量。
   (五)親和色譜法（ligh performance affinity chromatography）親和色譜法是利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從生物樣品中分離和分析一些特殊物質的色譜方法。生物分子之間的專一作用包括抗原與抗體，酶與抑制劑，激素和藥物與細胞受體，維生素與結合蛋白，基因與核酸之間的特異親和作用等。親和色譜的固定相是將配基連接于適宜的載體上而制成的，利用樣品中各種物質與配基親和力的不同而達到分離。當樣品溶液通過色譜柱時，待分離物質X與配基L形成X-L復合物，而被結合在固定相上，其他物質由于與配基無親和力而直接流出色譜柱，用適宜的流動相將結合的待分離物質洗脫，如采用一定濃度的醋酸或氨溶液為流動相，減小待分離物質與配基的親和力，使復合物離解，從而將被純化的物質洗脫下來。
HPAC可用于生物活性物質的分離、純化和測定，還可以用來研究生物體內分子間的相互作用及其機理等。
   (六)手性色譜法（chiral chromatography）不少有機藥物的結構中有不對稱碳原子，又稱手性碳原子，有手性碳原子的藥物具有旋; 光性。立體構型不同的一對對映體，其藥效、毒副作用往往不相同。例如抗高血壓藥物а-甲基多巴是S-（-）體；又如氯霉素（含有二個手性碳原子），只有D-（-）異構體有效．而L-（+）異構體完全無效。沙利度胺（反應停）的兩個對映體對小鼠鎮靜作用的效價相近，但只有左旋異構體才有胚胎毒及致畸作用。因此，對映體的分離，在藥物的制備和質量控制方面，都具有重要的意義。對映體在普通條件下的理化性質是相同的，因此分離對映體需要在手性條件下進行。分離對映體的色譜方法稱為手性色譜法。手性色譜法分為間接法和直接法兩種。間接法是將對映體與一定的手性衍生化試劑反應，使其由對映體轉變為非對映體，再利用他們理化性質的差異，用一般的色譜條件進行分離。直接法不需作衍生化反應，直接利用手性色譜柱或手性流動相進行分離，應用較多，以下主要介紹直接法。
   1.手性固定相（chiral stationary Phase，CSP）手性藥物拆分前的對映體通常以鏡象存在，即以外消旋體形式存在。用常規分析和制備方法不能將其拆分，需引入不對稱（即手性）環境，使欲拆分的對映體（樣品）、手性作用物（比如固定相）和手性源形成一個非對映異構分子的絡合物。為了形成這樣一種分子絡合物，分子之間要有一種同時相互存在的作用力，以保持分子的空間定位。Dalgliesh認為至少要有三個作用力，其中一個要有立體選擇性，可以是吸引的，也可以是排斥的。這就是“三點相互作用”理論。如果對映體中某一種對映體正好與此三個作用點配對，相互作用較強，保留時間就長。而另一種對映體因空間構型不同，不能完全配對，作用相對較弱，保留時間就短，從而可以得到分離。固定相的作用可以是氫鍵、偶極一偶極作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用等。
   l.1常用的手性固定相有以下幾種。
    (1) Pirkle型手性固定相
Pickle型手性固定相是由美國學者Pirkle主持研制的，主要有π-堿性（斥電子基）手性固定相和π-酸性（吸電子基）手性固定相。在分離的過程中，化合物與固定相之間發生π-π電荷轉移相互作用，此類固定相為電荷轉移型手性固定相。
    (2) 蛋白質類手性因定相
蛋白質是由手性亞基團氨基酸組成的大分子物質，蛋白質類手性固定相是將蛋白質通過氨基酸鍵合到硅膠上而制成的。常用的蛋白質類手性固定相有牛血清蛋白（RSA）和人血a1-酸性糖蛋白（AGP）的手性固定相，商品有Chiral AGP，Resolvosil， Enantio Pac等。
蛋白質類手性固定相應用范圍較廣，效果良好，但該類固定相的譜柱容量較小。常用洗脫系統是磷酸鹽緩沖溶液（PH4～7），離子強度為0～500mmol，有機改性劑不得超過5%。用蛋白質類手性固定相拆分酸性和堿性傾倒物對映體時，流動相內可分別加少量離子對試劑，如N，N-二甲基辛胺，叔丁胺氫溴酸鹽和辛酸，以獲得理想的分離結果。
    (3)多糖類手性固定相
多糖類手性固定相中應用最多的是環糊精。環糊精（cyclodextrin, CD)是一類環形寡聚糖，為手性高分子物質，。根據分子中葡萄糖單元的個數不同，環糊精可分為α、β、γ三類，他們分別由6、7、8個D-吡喃葡萄糖組成，將CD分別通過硅烷鏈連接在硅膠表面就構成環糊精手性固定相。環糊精分子成錐桶狀，內腔的直徑由組成環糊精的葡萄糖個數決定，如常用的β-環糊精由7個葡萄糖分子組成，內腔直徑為0.8nm。
用環糊精手性固定相進行分離時，首先要求被拆分的組分進人洞穴，形成包合物，保留時間以組分能否進人洞穴及其緊密的程度而定，環糊精環上還有多個手性中心，能選擇性地; 與對映體作用，從而導致對映異構體的保留不同而被分離。如用β-環糊精手性固定相已經成功地分離了二茂鐵等金屬有機絡合物、氨基酸以及生物堿等。
除環糊精外，多糖類的手性固定相還可以用纖維素、直鏈淀粉作成，如纖維素三醋酸醋手性固定相、纖維素三苯甲酸醋手性固定相和纖維素氨基甲酸酯手性固定相等。
    (4)冠醚（Grown ether）類手性固定相
冠醚與環糊精類似，是本身具有手性的低聚糖，是含醚鍵的環狀化合物，呈王冠狀結構，外層是親脂性的乙撐基，環的內層是富電子的雜原子，如氧、氮、硫等。通常使用的是18-冠-6的衍生物，健合在聚苯乙煒骨架或硅膠上，形成冠醚手性固定相。用冠醚手性固定相分離對映體時，不同對映異構體因與冠醚環腔形成的主客體絡合物的穩定性不同而被分離。在冠醚上引人雙萘基，雙萘基可以形成“手性墻”，增加固定相的立體選擇性。能質子化的氨基化合物，特別是氨基酸對映體在冠醚手性固定相上可以得到很好的分離。
除以上手性固定相外，還有模擬酶手性固定相、配位交換手性固定相等。
   2.手性流動相（chiral mobile phase ，CMP）拆分法
手性流動相拆分法是將手性試劑添加到流動相中，利用手性試劑與對映異構體結合的穩定常數不同或結合物在固定相上分配的差異進行分離。近年來，手性流動相拆分法已廣泛應用于藥物對映體的拆分。此法的最大優勢在于：可采用普通的非手性固定相，不需對樣品進行衍生化，手性添加物本身可流出，也可更換，同時添加物的可變范圍較寬，穩定性好，且價格便宜。
    (1) 配體交換型手性添加劑
配體交換型手性添加劑由手性配基和含二價金屬離子的鹽組成。手性配基多為具有光學活性的氨基酸及其衍生物，他們和二價金屬離子螯合，分布于流動相中，遇到待分離的對映異構體時，即形成配合物，再在流動相和固定相之間分配而實現分離。分離的機理一般認為是配基和金屬離子形成的螯合物被吸附在固定相上，形成動態的手性固定相而發揮作用。也可以看成是手性配基、金屬離子和對映異構體形成的配合物穩定常數不同而產生分離。采用5µm粒徑的C18 固定相，阿司帕坦作為CMPA，與硫酸銅絡合，測定高血溶素患者
尿中D-和L-2-哌啶酸的濃度。
    (2)環糊精添加劑
環糊精在水中有一定的溶解度，用環糊精作為手性添加劑，加入流動相中，其分離機理與環糊精手性固定相相同，但保留行為正好相反。對映異構體與環糊精形成的包合物穩定性越強，隨流動相出柱越快，保留時間越短。
    (3) 手性離于對添加劑
解離的有機化合物能與含互補電荷的試劑相互作用，生成電中性離子對。分離帶電荷的對映異構體時，可以在流動相中添加手性的離子對試劑，對映異構體和離子對試劑形成電中性的離子對，離子對在固定相和流動相間分配系數不同而得到分離。常用的手性離子對試劑有（＋）10-樟腦磺酸、奎寧等。

二、高效液相色譜儀高效液相色譜儀主要由輸液系統、進樣系統、色譜柱系統、檢測系統、數據記錄處理系統等組成。
   (一)輸液泵
    高效液相色譜的流動相采用高壓泵輸送，有不同類型的輸液泵，按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。目前使用較多的是柱塞式往復泵，柱塞式往復泵為恒流泵，可按設定的流速輸送流動相，流量不受柱阻力的影響，可保持恒定，并容易清洗和更換。由于柱塞式往復泵是通過柱塞的往復運動來關液的，所以輸液的脈動性較大。目前多采用雙泵補償的方法減小脈動性。雙泵補償是同時使用兩個泵進行工作，兩個泵可以按串聯或并聯方式連拉，交替送液，相互補償，達到減小脈動的目的。
   (二)進樣器
    進樣器是將試樣送入色譜柱的裝置。一般要求進樣裝置的密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。有進樣閥和自動進樣裝置兩種。除使用自動進樣裝置外，用手工進樣均使用六通進樣閥。在工作狀態下，儀器系統內處于高壓的狀態，借助于六通進樣閥，實現了常壓下不停流進樣。
    六通進樣閥可分為定子和轉子兩部分，共有6個口，故稱為六通進樣閥。轉子通過扳手調節，可以分別處于“裝樣”和“進樣”兩個位置。當將扳手扳至“進樣”位時，進樣閥的流路發生了改變，流動相通過樣品管，將注入的樣品帶入色譜柱進行分析。六通進樣閥具有使用方便，進樣量準確等優點。樣品環有10µl、20µl、50µl等不同容積，可以選配。樣品環不僅可以用來貯液，也可用來測量樣品溶液的體積。將樣品環裝滿后，進樣，進樣量即為樣品環的容積，此種進樣方式稱為“滿環進樣”或“定量環進樣”。用定量環進樣精密度好，在使用外標法時，應使用此種操作方式。
   (三)色譜柱色譜柱是色譜分離的核心。為了保證色譜柱的柱效高，使用壽命長，一般使用由專業化工廠生產的商品柱。色譜柱管多由不銹鋼制成，內裝一定的固定相。色譜往長一般10～30cm，內徑2～5mm。
    化學鍵合相是廣泛使用的固定相，其中又以十八烷基硅烷鍵合硅膠（octadecylsilyl silicagel，ODS）的應用最為廣泛，ODS為非極性化學健合相，此外還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等，非極性化學健合相用于反相色譜法。中等極性的化學鍵合相有苯基化學鍵合相等，氰基化學鍵合相和氨基化學鍵合相是常用的極性化學鍵合相，極性的化學鍵合相一般用于正相色譜法。吸附色譜的固定相中使用最多的是硅膠。無論自己填裝的色譜柱還是購買的商品柱，使用能指標包括在一定實驗條件下的柱壓、理論塔板高度和理論塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性等。
   (四)檢測器樣品經色譜柱分離后進入檢側器進行檢測。按其適用范圍檢測器可分為通用型和專屬型兩大類，專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質，紫外檢測器(UVD），熒光檢測器（ED）屬于這一類，它們只對有紫外吸收或熒光發射的組分有響應；通用型檢測器檢測的是一般物質均具有的性質，示差折光檢測器（RID），蒸發光散射檢測器（ELSD)等。
   液相色譜-質譜聯用(LC-MS)則是用質譜作為高效液相色譜的檢測器。
   1.紫外檢測器
    (1)普通紫外檢測器
    紫外檢測器是高效液相色譜中應用最廣的一種檢測器。用一定波長的單色光照射流通池，流動相攜帶被分離的組分進入流通池時，流動相在測定波長處不吸收光或吸收很弱，測定組分在該波長處有很強的吸收，記錄不同時間對光的吸收度，就得到一張色譜圖。組分對光的吸收符合Iambert-beer定律，因此色譜峰的面積和組分的量成正比關系。紫外檢測器的特點是靈敏度高，線性范圍寬，對溫度和流動相的波動不敏感，可用于梯度洗脫。但紫外檢測器只能檢測具有紫外吸收的組分，像糖類、脂肪酸類等在測定范圍內無紫外吸收的組分不能檢側。用普通紫外檢側器也不便測定流出組分的紫外吸收光譜，有的紫外檢測器雖可測定紫外吸收光譜，但在組分到達檢測器時需停流，再掃描。
   (2) 光二極管陣列檢瀏器(photodiode array detector，PDAD）
光二極管陣列檢測器是20世紀80年代出現的一種光學多通道檢測器，它可以在瞬間完成對組分的紫外掃描。
    由光源發射的光照射流通池，被組分選擇性地吸收，透過光通過光柵分光，形成組分的紫外吸收光譜，照射在成矩陣排列的光二極管上，光二極管將光信號轉換為電信號，輸出的電信號與光的強度成正比，電信號經過累加、處理，就可以得到組分的紫外吸收光譜。因此，使用PDAD，可以在瞬間獲得組分的紫外吸收光譜，而不需停流進行紫外掃描。光二極管的個數越多，圖譜的分辨率越高，若有512個光二極管，在190～800nm范圍內掃描，則平均每1.2nm對應一個光二極管。
用PDAD按設定的時間間隔采集數據，可以得到一張三維的光譜-色譜圖。吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量。應用三維圖譜還可以對峰的純度進行檢查。若一個色譜峰包含有兩個組分，則不同位置的紫外吸收光譜會有差異通過比較色譜峰不同位置紫外光譜圖的一致性，可以進行色譜峰的純度檢查。
   2．熒光檢測器
熒光檢測器是利用組分發出的熒光進行檢測的方法。熒光檢測器的靈敏度比紫外檢測器高，檢測限可以達到1×10-10g/ml，但組分必須有熒光。許多藥物和生物活性物質具有天然熒光，能直接檢測，如生物胺、維生素和甾體化合物搶救無效；通過熒光衍生化可以使本來沒有熒光的化合物轉變成熒光衍生物，從而擴大了熒光檢測器的應用范圍，例如氨基酸。由于熒光檢測器的高靈敏度和選擇性，它是體內藥物分析常用的檢測器之一。
   3．蒸發光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELSD）
蒸發光散射檢測器是在90年代出現的一種新型的通用型檢測器，主要適用于無紫外吸收，不能用紫外檢測的組分，如糖類、脂肪酸、甘油三酯及甾體等。
ELSD的檢測可分為三個步驟。
   (1)霧化在霧化器中，洗脫液通過1個針孔與氮氣（也可以用空氣）混合，形成均勻的霧狀液滴。
   (2）流動相蒸發液滴通過加熱的漂移管時，流動相被蒸發，樣品組分形成氣溶膠，進人檢測室。
   (3）檢測在檢測室內，用激光來照射氣溶膠，產生散射，測定散射光強，記錄散射光強度隨時間的變化關系，就得到了色譜圖。
    氣溶膠受固定光強的激光照射后，待測組分的質量(m）和散射光強度(I)有以下的關系I=Kmb; lgI=blgm+lgK式中K和b為與蒸發室溫度和流動相性質有關的常數。上式說明散射光的對數響應值與組分的質量的對數成線性關系。
    ELSD用來測定那些不能用紫外檢側器檢側的組分，對HM的檢測器是很重要的補充。但ELSD對有紫外吸收的組分檢測靈敏度相對較低．此外，它只適合流動相能完全揮發的色譜條件，若流動相含有難以揮發的緩沖劑時，就不能用ELSD進行檢測。
   4.液相色譜一質譜聯用（LC-MS)液相色譜-質譜聯用技術（LC- MS）是用質譜作為HPLC的檢測器，它將HPLC的高分離效能和質譜的高靈敏度、高專屬性、通用性及較強的結構解析能力相結合，成為藥品質量控制、體內藥物分析和藥物代謝研究的最重要的手段。由于質譜的工作系統是處于真空狀態的，若將液相色譜的流出液直接引人質譜儀，流出液揮發產生的大量氣體，會使質譜儀無法正常工作。因此，LC-MS的關鍵是接口，目前應用較多的接口有以下幾種。
   (1)粒子束（PB）接口使用粒子束接口時，來自HPLC的洗脫液經霧化器霧化，變成氣溶膠微粒，霧化的工作氣體是氦氣。溶劑在脫溶劑室被蒸發，再進入動量分離器，在動量分離器內由于溶劑和測定組分的質量有很大差別，二者之間會出現動量差，動量較小的溶劑和噴射氣體（氦氣）被抽氣泵抽走，測定組分則沿傳輸管進入質譜儀的離子源。使用粒子束接口時，可使用EI（電子轟擊離子源）或CI（化學離子源），因而可以得到經典的質譜圖，并可以使用圖譜庫檢索，對未知樣品的分析非常有用，但不適用于對熱不穩定的化合物的分析。
   (2)熱噴霧接口（TSP)熱噴霧接口是在液態下將樣品分子離子化的方法。流動相在經過噴霧探針時被加熱，體積膨脹后以超聲速噴出探針，形成霧滴。液滴在離開噴嘴時由于統計漲落分別帶上多余的正電荷或負電荷，當它在運動中不斷失去溶劑，液滴的半徑足夠小時，表面電荷形成很強的電場，導致組分離解。也可以采用熱燈絲發射電子束轟擊溶劑和測定組引發化學電離。TSP適用于含水比例較高、流速較高(1ml/min～ 2ml/min）以及極性較大的測定組分的分析。
   (3)大氣壓離子化（API）接口大氣壓離子化接口是指離子化在常壓下進行的接口，API是目前LS-MS中應用最廣的接口。API有電噴霧(ESP)、離子噴霧(ISP)和大氣壓化學電離(APCI)三種操作模式。
   (五)數據記錄處理和計算機控制系統
    現代HPLC的的特征是用微機控制儀器。HPLC儀器的中心計算機控制系統，即能做數據采集和分析工作，又能程序控制儀器的各個部件，還能在分析一個試樣之后自動改變條件而進行下一個試樣的分析，許多色譜儀的軟件系統具有方法認證功能，使分析工作更加規范化。

三、在藥物分析中的應用;高效液相色譜法分離效能高，應用范圍廣，靈敏度高，儀器已較成熟、普及，在新藥的研究開發，藥品檢驗，生物樣品的分析中應用十分廣泛。
   (一)色譜系統適用性試驗
    由于色譜分離的效果受色譜柱的狀況，流動相組成等因素的影響很大，為保證測定結果的準確，中國藥典規定，在進行色譜分析前需檢查色譜系統是否正常，是否符合要求，即需要作色譜系統適用性試驗，色譜系統適用性試驗的內容有：
   1. 色譜柱的理論板數
在規定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液記錄色譜圖，量出測定組分或內標物質峰的保留時間tR和半高峰寬（Wh/2），按下式計算色譜往的理論板數：;n=5.54(tR/Wh/2)2如果測得理論板數低于各品種項下的規定，應更換色譜柱或其他條件使理論板數達到要求。色譜柱的理論板數主要取決于半高峰寬Wh/2，在一定的條件下，wh/2越窄，理論板數越高，相鄰峰的分離越好。
   2.分離度（R)
分離度用來表示相鄰兩峰分離的程度。分離度（R）的計算公式為：2(tR2―tR1);R=;
W1+W2除另外有規定外，分離度應大于1.5。當分離度大于1.5時，相鄰兩峰達到了完全分離。
   3. 重復性
取各品種項下的對照品溶液，連續進樣5次，除另有規定外，峰面積的相對標準偏差(RSD)應不大于2.0%。也可按各品種校正因子測定項下，配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別進樣3次，計算平均校正因子，其相對標準偏差也應不大于2.0%。
   4. 拖尾因子（T)
拖尾因子用來表示峰的對稱性。為保證測定結果的準確，特別當采用峰高法定量時，應檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規定，拖尾因子計算公式為W0.05hT= 2d1除另有規定外，T應在0.95～1.05之間。
   (二)在藥物分析中的應用
   1.在鑒別中的應用
    在HPLC法中，保留時間與組分的結構和性質有關，是定性的參數，可用于藥物的鑒別。如中國藥典收載的藥物頭孢羥氨芐的鑒別項下規定：在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時間應與對照品主峰的保留時間一致。頭抱拉定、頭孢噻酚鈉等頭孢類藥物以及地西泮注射液、曲安奈德注射液等多種藥物均采用HPLC法進行鑒別。
   2.在雜質檢查中的應用
    HPLC分離效能高，靈敏，在藥物的雜質檢查中應用廣泛。主要用于藥物中有關物質的檢查。“有關物質”是指藥物中存在的合成原料、中間體、副產物、降解產物等物質，這些物質的結構和性質與藥物相似，含量很低，只有采用色譜的方法才能將其分離并檢測。若雜質是已知的，又有雜質的對照品，可用雜質對照品做對照進行檢查。若雜質是未知的，可以采用主成分自身對照法或峰面積歸一化法進行檢查。
   3．在含量測定中的應用
用高效液相色譜法側定含量可以消除藥物中的雜質，制劑中的附加劑及共存的藥物對測定的干擾。中藥材及其制劑組成復雜，基中不少有效成分的含量測定也越來越多地采用了高效液相色譜法。
   4.手性分離
   5.在藥濃檢側中的應用
    示例：對乙酰氨基酚急性中毒的血藥濃度檢測分析對乙酰氨基酚是臨床上使用極其廣泛的解熱鎮痛藥。由于患者狀態的多樣性以及對酰氨基酚中毒的早期癥狀與胃潰瘍癥狀極其相似且肝功正常，故常常發生漏診，等到發生肝損傷已經錯過了治療最佳時機。因此，國外已將對乙酰氨其酚血濃度作為急診中毒病人常規檢測。色譜條件：采用Nova-PakC18柱（4µm,150mm×3.9mm），柱溫25℃；流動相為甲醇-水（30:30），流速為0.8ml/min；二極管陣列檢測器，檢測波長254nm。血漿樣品制備; 取靜脈血3ml～4ml，置含肝素抗凝劑的離心管中，離心分離5min（3000r/min），上清液為待測血漿。取上述血漿1ml，加飽和硫酸鋅溶液1ml，沉淀蛋白后，加入乙醚5ml，渦漩混合1min，離心20min（3000r/min）。精密吸取乙醚液3.0ml于50℃氮氣流吹干，冷至室溫，以蒸餾水500µl溶解殘渣，取10µl進樣。對照品溶液制備; 配制對乙酰氨基酚甲醇溶液（10mg/ml），并用甲醇逐級稀釋成濃度為0.01mg/ml～5mg/ml的對照品溶液，4℃冰箱存放備用。血漿中對乙酰氨基酚標準曲線制備; 取肝素抗凝的血漿1ml，分別加入不同濃度的對乙酰氨基酚工作液100µl，使血漿中藥物濃度為0.9µg/ml～454.5µg/ml，再按“血漿樣品制備”項下方法操作，記錄色譜圖，以溶液C對峰面積A作線性回歸，得回歸方程：A=1.64×104+1.68×107C，R=0.9995，線性范圍為0.9µg/ml～454.5µg/ml，最低檢測濃度為0.9µg/ml(以信噪比≥3計)。用HPLC測定可疑中毒病人血中對乙酰氨基酚濃度具有準確、快速的優點，可有效地幫助臨床醫生確診，快速有效地救治患者，對提高醫療質量有重要意義。液、組織中藥物的濃度，在藥物代謝動力學研究、臨床血藥濃度檢測中應用非常廣泛。