近日，中國科學院南海海洋研究所研究員鞠建華團隊在J. Am. Chem. Soc.（2016, 138 (1), 408-415）發表文章首次闡述天然產物中L-allo-Ile結構單元的生物合成機制，論文被同期JACS Spotlights (2016, 138, 461) 作為研究亮點評述。該成果為研究其它生物體中L-allo-Ile的來源和生物醫療提供了思路；“氨基轉移酶”和異構酶組成的酶對還可以作為遺傳標記，指導發現（通過基因挖掘手段）自然界中含L-allo-Ile結構單元的新穎天然產物用于藥物開發。

　　異亮氨酸（Ile）具有兩個手性中心，存在4種立體異構體：（2S,3S）L-異亮氨酸（l-Ile）、（2R,3R）d-異亮氨酸（d -Ile）、（2S,3R）L-別異亮氨酸（L-allo-Ile）和（2R,3S）d-別異亮氨酸（d-allo-Ile）。L-allo-Ile在自然界不同生物體中廣泛存在，包括微生物天然產物、植物和人體血漿中。在健康人群的血漿中，L-allo-Ile處于幾乎被檢測不到的濃度水平；但在患有罕見的常染色體隱性遺傳病——楓糖尿癥（maple syrup urine disease）患者的血漿和尿液中，L-allo-Ile卻因為患者的對異亮氨酸和其它支鏈氨基酸的代謝缺陷而得到累積，濃度達到5μM以上。因此，L-allo-Ile在血漿中的濃度水平已經作為診斷楓糖尿癥的重要指標之一。但L-別異亮氨酸自50多年前被發現以來，其生物合成機制尚不清楚。

　　研究人員從來源于我國南海深海的鏈霉菌發酵液中分離到抗感染環肽類抗生素desotamides和marformycins，其化學結構中均含有L-allo-Ile結構單元。通過生物信息學分析方法，在desotamide和marformycin的生物合成途徑中分別鑒定了一對由磷酸吡哆醛（pyridoxal5’-phospahte, PLP）依賴的“氨基轉移酶”和新穎異構酶（isomerase）組成的酶對DsaD/DsaE和MfnO/MfnH。實驗證實了DsaD/DsaE和MfnO/MfnH參與L-allo-Ile結構單元的生物合成，氨基轉移酶DsaD/MfnO的敲除使desotamides和marformycins的產量明顯降低，異構酶DsaE/MfnH的敲除使突變菌株完全喪失生產含L-allo-Ile結構單元的desotamide和marformycin組分的能力。

　　研究人員在大腸桿菌中對DsaD/DsaE和MfnO/MfnH分別進行了表達和純化，發現純化的“氨基轉移酶”DsaD/MfnO蛋白溶液呈黃色，紫外掃描提示DsaD/MfnO通過希夫堿的形式與輔因子PLP共價相連。體外生化實驗證明，DsaD/DsaE和MfnO/MfnH在不需要添加額外輔因子的條件下可以協作催化L-Ile和L-allo-Ile間的可逆轉化，可逆反應平衡常數為1.37。體外蛋白定點突變實驗證明，氨基轉移酶DsaD和MfnO的催化位點分別是其第198位和第206位賴氨酸殘基，異構酶DsaE和MfnH的關鍵催化位點分別是位于其C-端的第115位和第107位精氨酸殘基。

　　基于實驗結果，提出了DsaD/DsaE或MfnO/MfnH的可逆協作催化機理：底物L-Ile首先替換“氨基轉移酶”MfnO（或DsaD）與PLP通過希夫堿的形式形成PLP-L-Ile復合物；“氨基轉移酶”MfnO的Lys206（或DsaD的Lys198）對PLP-L-Ile復合物中l-Ile的a碳位去質子化，形成醌式中間體復合物；異構酶MfnH的Arg107（或DsaE的Arg115）先對醌式中間體復合物的b碳位進行去質子化，形成烯胺中間體復合物，接著再對烯胺中間體復合物的b碳位進行重新質子化，完成b碳位立體構象的改變；MfnO的Lys206（或DsaD的Lys198）對a碳位重新進行質子化，獲得產物L-allo-Ile；當以L-allo-Ile作為底物時，以上機理可逆向進行。

　　李青連為論文的第一作者，成果得到了國家自然科學基金和“863”計劃項目的資助。

南海海洋所揭示L-別異亮氨酸的生物合成機制