單細(xì)胞中心前期已經(jīng)證明拉曼組能夠快速區(qū)分細(xì)胞藥物應(yīng)激機(jī)制(Teng L, et al, Sci Rep, 2016)。因此，拉曼組技術(shù)預(yù)期將成為指導(dǎo)“個(gè)體化”臨床精準(zhǔn)用藥與耐藥性快檢的新手段與新標(biāo)準(zhǔn)之一，同時(shí)，也為新型抗菌藥物篩選與研發(fā)提供了嶄新的共性技術(shù)平臺(tái)。

 抗生素的不當(dāng)使用一方面貽誤病情、導(dǎo)致復(fù)發(fā)感染，甚至造成人體菌群紊亂，誘導(dǎo)其它疾病的發(fā)生，另一方面則加速耐藥菌乃至“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)。因此，如何實(shí)現(xiàn)“快、準(zhǔn)、狠”的抗生素精準(zhǔn)用藥既是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的重要前沿，也是遏制耐藥性蔓延的核心挑戰(zhàn)之一。而準(zhǔn)確全面的抗菌效果評(píng)價(jià)技術(shù)是抗生素精準(zhǔn)用藥的前提與基礎(chǔ)。近日，中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所單細(xì)胞中心與中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院合作發(fā)表了基于重水標(biāo)記單細(xì)胞拉曼成像的藥物抗菌效果評(píng)價(jià)技術(shù)，在單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞精度快速測(cè)量藥物對(duì)細(xì)胞代謝活性的抑制性。以此為基礎(chǔ)提出的“基于代謝活性的最低抑菌濃度”(“MIC-MA”指數(shù))，與目前臨床用藥普遍依據(jù)的“最低抑菌濃度”(“MIC”指數(shù))相比具有重要的特色與優(yōu)勢(shì)，因此有望成為指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)用藥的新標(biāo)準(zhǔn)之一。該工作近期發(fā)表于《分析化學(xué)》(Analytical Chemistry)。

 據(jù)專家估算，目前在必須使用抗生素治療的臨床案例中，高達(dá)30~50%存在著治療方案制定、抗生素選擇或抗生素療程等方面的錯(cuò)誤;在重癥監(jiān)護(hù)中，約30~60%的抗生素處方均存在非必要抗生素的濫用、非對(duì)癥抗生素或者非最佳抗生素組合方案等問(wèn)題。與此同時(shí)，目前每年約有70萬(wàn)人死于耐藥菌感染;到2050年，這一數(shù)目將激增至每年1000萬(wàn)人，大約為每年死于各種癌癥的病人總數(shù)。因此，2016年9月22日聯(lián)合國(guó)大會(huì)193個(gè)成員國(guó)共同簽署了歷史性宣言，承諾通力合作掃除“超級(jí)耐藥病菌”。2016年8月26日中國(guó)國(guó)家衛(wèi)計(jì)委等14部門聯(lián)合印發(fā)的《遏制細(xì)菌耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃(2016-2020)》中明確提出，要“加強(qiáng)抗菌藥物應(yīng)用和耐藥控制體系建設(shè)”和“完善抗菌藥物應(yīng)用和細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)體系”。準(zhǔn)確全面的抗菌效果評(píng)價(jià)技術(shù)是抗生素精準(zhǔn)用藥的前提與基礎(chǔ)，但是，臨床需求與技術(shù)現(xiàn)狀的矛盾如此緊迫和突出，以至于2016年9月8日美國(guó)NIH懸賞二千萬(wàn)美元，專門激勵(lì)細(xì)菌耐藥性臨床快檢技術(shù)的研發(fā)。

 基于重水標(biāo)記單細(xì)胞拉曼成像的藥物抗菌效果評(píng)價(jià)技術(shù)示意圖
迄今為止，MIC指數(shù)，即體外培養(yǎng)細(xì)菌24小時(shí)后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)病原菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度，一直是微生物藥敏試驗(yàn)、抗菌藥效評(píng)價(jià)和臨床抗菌方案制定的主流標(biāo)準(zhǔn)與主要依據(jù)之一。然而其測(cè)量不僅耗時(shí)耗力，且對(duì)難以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)或生長(zhǎng)緩慢的病菌無(wú)能為力。尤其關(guān)鍵的是，MIC只能從抑制細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)增這一角度反映與測(cè)量藥效，卻無(wú)法檢測(cè)處于“NGMA”(Non-Growing but Metabolically Active)狀態(tài)的病菌，即在藥物作用下已經(jīng)不再增殖但仍然具備代謝活性的存活細(xì)胞。這種狀態(tài)的病菌在臨床上十分常見，如果在抗菌治療中成為漏網(wǎng)之魚，將貽誤病情，引起復(fù)發(fā)性感染，進(jìn)而誘導(dǎo)耐藥菌乃至“超級(jí)細(xì)菌”的頻繁出現(xiàn)。因此根據(jù)MIC制定抗菌治療方案有可能出現(xiàn)“不夠快、不夠準(zhǔn)、不夠狠”的情況。

 針對(duì)上述瓶頸問(wèn)題，研究人員開發(fā)了基于拉曼組(Ramanome)的細(xì)菌藥物應(yīng)激效應(yīng)成像技術(shù)(如圖)，有效地克服了上述缺陷。該研究以導(dǎo)致齲病的變形鏈球菌(Streptococcus mutans)與多種臨床常見抗菌藥物為模式，證明單細(xì)胞拉曼成像能夠精確測(cè)量細(xì)胞利用胞外重水(D2O)分子的速率，而后者與該細(xì)胞的代謝活躍程度呈高度的正相關(guān)。因此與重水標(biāo)記耦合的單細(xì)胞拉曼成像能夠從對(duì)微生物代謝活性抑制的角度定量測(cè)量藥效，讓處于“NGMA”狀態(tài)的細(xì)胞無(wú)所遁形，從而使抗菌治療方案“夠準(zhǔn)”。同時(shí)，由于該方法具備單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的精度，因此對(duì)于絕大部分細(xì)菌、古菌和真菌，該方法能夠測(cè)量同一樣品內(nèi)不同細(xì)胞之間在抗菌效應(yīng)上的差異程度，評(píng)價(jià)病菌細(xì)胞群體或群落在藥物作用下是否已被“趕盡殺絕”，從而使抗菌治療方案“夠狠”。實(shí)驗(yàn)還證明，該方法能夠在半小時(shí)內(nèi)快速區(qū)分氟耐受型和氟易感型的變形鏈球菌，這一高度靈敏性對(duì)于評(píng)價(jià)抗菌效果是否“夠快”具有重要意義。

 基于上述重水標(biāo)記單細(xì)胞拉曼成像技術(shù)，研究人員提出了名為“基于代謝活性的最低抑菌濃度”(“MIC-MA”指數(shù))的抗菌藥效指標(biāo)，即藥物作用8個(gè)小時(shí)后所有細(xì)胞其代謝活性徹底、且全都被抑制的最低藥物劑量。對(duì)于特定病菌和特定抗菌藥物，MIC-MA指數(shù)與MIC指數(shù)顯著不同。在該研究測(cè)試的三種抗菌藥物的MIC劑量下，盡管變形鏈球菌細(xì)胞群體已經(jīng)不再生長(zhǎng)與擴(kuò)增，但大部分的細(xì)胞都仍然保持著一定的代謝活性。事實(shí)上，在高達(dá)60倍MIC的氨芐西林劑量時(shí)，仍然存在高比例的“NGMA”狀態(tài)的變形鏈球菌細(xì)胞，這導(dǎo)致在抗生素壓力消失時(shí)病菌“星火燎原”，發(fā)生復(fù)發(fā)性感染。這說(shuō)明MIC-MA在評(píng)價(jià)抗菌藥效是否“快、準(zhǔn)、狠”等方面，與目前臨床上普遍參照的MIC相比，具有重要的特色與優(yōu)勢(shì)。

 此外，傳統(tǒng)MIC檢測(cè)將受試微生物作為同質(zhì)化的群體來(lái)看待，忽視了針對(duì)細(xì)胞之間藥效異質(zhì)性的考察與評(píng)價(jià)。而MIC-MA在單個(gè)細(xì)胞精度的藥敏性與藥效檢測(cè)，對(duì)于研 究考察耐藥性形成與微進(jìn)化機(jī)制等方面具有重要意義。

 單細(xì)胞中心前期已經(jīng)證明拉曼組能夠快速區(qū)分細(xì)胞藥物應(yīng)激機(jī)制(Teng L, et al, Sci Rep, 2016)。因此，拉曼組技術(shù)預(yù)期將成為指導(dǎo)“個(gè)體化”臨床精準(zhǔn)用藥與耐藥性快檢的新手段與新標(biāo)準(zhǔn)之一，同時(shí)，也為新型抗菌藥物篩選與研發(fā)提供了嶄新的共性技術(shù)平臺(tái)。

 青島能源所單細(xì)胞中心研究員徐健和中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院教授凌均棨為論文的共同通訊作者，聯(lián)合培養(yǎng)博士生陶一帆是論文的第一作者。該工作獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金委、中科院生物高通量檢測(cè)分析技術(shù)服務(wù)網(wǎng)絡(luò)(STS)等的支持。